Как биологам удалось создать у мышей ложные воспоминания

Нобелевский лауреат Сусуму Тонегава во время июльской конференции FEBS 2013 в Санкт-Петербурге впервые рассказал про эксперимент, в ходе которого мышам удалось внедрить ложную память. Несколько дней назад подробности работы появились в Science. В том, что подразумевается под ложной памятью и как и куда ее удалось внедрить, разбиралась «Лента.ру».

Представим, что вы разведчик будущего и отправляетесь на опасное задание, где вам предстоит попасть в самое логово врага. Вас, как и разведчиков старой закалки, тренировали запоминать цифры, имена, лица и другие подробности, но у вас, в отличие от них, в кармане есть гораздо более эффективное оружие — небольшая таблетка, которую нужно выпить непосредственно перед заданием. Вы проглатываете таблетку, знакомитесь с секретными документами, с боем выбираетесь из бункера противника и наконец попадаете к своим.

Как вспомнить в подробностях все то, что вы видели на вражеской территории? Кое-что вы припоминаете собственными усилиями, но, конечно, далеко не все, что нужно. Тогда вас отправляют к военным медикам, которые в ходе нехитрой операции вживляют в ваш мозг оптоволокно и там с его помощью облучают синим светом особую структуру. Вы лежите на кушетке, доктор нажимает на кнопку, и в этот момент вы вдруг оказываетесь снова в тылу врага, и все обстоятельства того, что там происходило, ощущаете как наяву. В результате боеголовки пересчитаны, секретный код восстановлен, Земля спасена.

Подобный сюжет уже слишком долго кочует из одного фантастического фильма в другой, чтобы хоть кому-то показаться оригинальным. Тем не менее мало кто знает, что эксперимент примерно с такой же фабулой (если не считать замены разведчиков на мышей) был опубликован в Nature уже около полугода назад, а сейчас появилось его продолжение.

Тогда ученые из Массачусетского технологического института под руководством нобелевского лауреата Сусуму Тонегава смогли при помощи направленного в гиппокамп синего света заставить мышей вспомнить определенный эпизод из их жизни, а именно — как животные однажды побывали в незнакомой для них клетке. Поскольку мыши не могли самостоятельно рассказать экспериментаторам о том, что им вспомнилось в момент включения света, об их ощущениях судили по внешнему поведению: в момент «озарения» грызуны замирали, поскольку в той самой незнакомой клетке их подвергали небольшому, но весьма неприятному удару током.

В норме такое поведение проявляется, когда мышей через некоторое время после удара током снова сажают в злополучную клетку — срабатывает классический павловский рефлекс. Изюминка нового эксперимента заключалась в том, что во время его проведения мыши были в безопасной, с их точки зрения, клетке — защитная реакция вызывалась не реальностью, а только активированными светом воспоминаниями.

Эксперимент Пенфилда

То, что воспоминания можно активировать прямым воздействием на мозг, известно уже довольно давно. Впервые это было случайно обнаружено американским хирургом Уалдером Пенфилдом.

Пенфилд был врачом и занимался лечением эпилепсии, разрушая те области мозга, которые были причиной возникновения аномальной активности. Понятно, что такая работа требовала точного определения границ патологических участков. Перед тем как приступить к их разрушению, Пенфилд проводил электрическую стимуляцию, в ходе которой пациенты находились в сознании и рассказывали о своих ощущениях. Таким операциям мы обязаны, помимо прочего, знаменитым гомункулюсом — рукастым и губастым человечком, изображение которого соответствует специализации различных участков коры. В ходе некоторых из подобных операций пациенты Пенфилда сообщали о том, что им с необычной яркостью вспоминались какие-то ранее пережитые события. Причем, судя по рассказам, это были не просто воспоминания, которые каждый может вызвать произвольно, но яркие вспышки озарения.
 

Уалдер Пенфилд в 1911 году в Принстоне
Фото: Library of Congress

Эксперименты Пенфилда приобрели очень широкую известность как в научной среде, так и за ее пределами. Многие интерпретировали его результаты так, как будто память представляет собой некий недремлющий видеорегистратор, который запоминает все, что человек видит и чувствует, хоть обычно и не может вспомнить произвольно. Оснований для такой интерпретации в самих экспериментах было мало — только некоторые из пациентов во время электростимуляции переживали вспышки памяти. Но даже если бы это было не так, нет повода думать, что случайность таких воспоминаний свидетельствует о всеобъемлемости памяти.

Ключевым свойством вызванных электростимуляцией воспоминаний является их случайность. При наличии пары электродов и пусть даже бесконечно терпеливого пациента невозможно научиться произвольно включать именно те воспоминания, которые мы по какой-то причине хотим оживить. Это связано, во-первых, с тем, что непонятно, как именно кодируются те или иные воспоминания — отвечают ли за них отдельные нейроны или их сети, а если сети, то как именно они формируются. Неясно, можно ли вообще вызвать воспоминание активацией одиночных клеток. Во-вторых, провести «направленное вспоминание» при помощи электростимуляции невозможно просто по той технической причине, что электрод — это очень грубый инструмент, который возбуждает сотни тысяч и миллионы разных нейронов. Понадобилось почти полвека исследований в очень разных областях науки (включая и те, что крайне далеки от нейробиологии), чтобы ученые смогли наконец подобраться к решению этой проблемы.

О пользе изучения водорослей

Когда Карл Дайсерот получил грант на создание своей первой собственной исследовательской группы, он меньше всего хотел начинать с рискованной тематики, от которой отказались другие исследователи. Однако именно этого требовала логика исследования, а возможности, которые открывались перед создателями новой технологии в случае успеха, были воистину фантастическими.

К моменту создания группы Дайсерота в области, казалось бы, никак не связанной с нейробиологией, произошло событие, которое имело ключевое значение для новой технологии — биоинформатики обнаружили несколько генов каналродопсинов у зеленых водорослей. Родопсины представляют собой чувствительные к свету трансмембранные белки, которые в ответ на облучение синим светом могут пропускать ионы внутрь клетки. Подобные белки позволяют получать энергию из света некоторым бактериям, а дальние родственники этих молекул обеспечивают чувствительность к свету клеток сетчатки глаза.

Карл Дайсерот
Фото: Stanford University

Открытие компактных и относительно простых родопсинов у водорослей означало, что их гены можно попытаться заставить работать в нейронах, и тогда облучение последних синим светом должно будет привести к электрохимическому возбуждению. С идеями контролировать работу нейронов при помощи света, а не электричества выступал в 1970-х годах еще Френсис Крик, но на протяжении десятилетий это не приводило ни к чему практическому. Открытие бактериальных родопсинов дало вторую жизнь этим идеям, но только Дайсероту и его сотрудникам удалось собрать из разрозненных методик работающую систему.

Как впоследствии отмечал сам Дайсерот, метод сработал гораздо лучше, чем кто-либо мог ожидать. Существовала тысяча причин, по которым все могло пойти не так (недаром многие исследователи не брались за амбициозную идею), но в реальности активация нейронов светом оказалась очень надежным методом.

Для введения генов родопсина в нейроны ученые использовали вирусы, которые инъецировали прямо в мозг подопытным крысам. Эти вирусы содержали гены, которые не просто кодировали светочувствительные белки-родопсины, но и имели элементы управления — такие, чтобы делать светочувствительными только нужную часть клеток. Кроме того, ученые разработали методы введения оптического волокна в определенную зону мозга, причем таким образом, чтобы подключенное к нему животное могло свободно двигаться. На несколько лет лаборатория Дайсерота превратилась в центр обучения исследователей со всего мира, которые хотели перенять новую методику для применения ее в собственных изысканиях. Сам же пионер оптогенетики переключился на создание новой технологии — метода осветления мозга, который позволяет рассмотреть в нем отдельные нейроны и их связи, ничего при этом не разрушая.

От памяти иммунной к памяти ложной

Адаптацией методики Дайсерота к исследованию памяти занялся нобелевский лауреат Сусуму Тонегава и сотрудники его лаборатории. Тонегава, родившийся в 1939 году в Японии, получил Нобелевскую премию за работы по исследованию механизма образования антител, которые отвечают за иммунологическую память. Как и Крик, Тонегава на пике карьеры решил поменять специализацию и занялся исследованием мозга, а конкретнее — механизмами памяти.

Тонегаве удалось совместить множество методик из разных областей науки и в некотором смысле довести до конца эксперимент Пенфилда, а затем сделать и еще один шаг — не просто стимулировать определенное воспоминание, но даже создать воспоминание о несуществующем событии. Как ему это удалось?

Ученые уже давно знают, что формирование памяти о любом событии сопровождается синтезом белка в нейронах. Какую роль играют эти белки и как они влияют на память — тема для отдельного разговора. Важно, что среди этих белков существуют такие, которые синтезируются только на самых ранних этапах этого процесса — они называются непосредственно ранние гены или просто «ранние гены» (immediate early genes).

В принципе, в разных тканях они могут участвовать в разных процессах, но в мозге (и особенно в его отделе гиппокампе) эти белки синтезируются только тогда, когда нейроны начинают активно что-то запоминать. Один из главных таких белков называется c-fos, и именно его использовали в лаборатории Тонегавы для того, чтобы «поймать» нейроны, которые хранят память о том или ином событии.
 

Сусуму Тонегава
Фото: ipop.gr

Прежде всего авторы получили специальную линию лабораторных мышей, которые одновременно с синтезом c-fos синтезировали специальный контролируемый транскрипционный фактор. Все нейроны, которые участвуют в образовании памяти у таких мышей, синтезировали этот транскрипционный фактор в тот момент, когда с мышью происходило что-то необычное, например, она оказывалась в незнакомой клетке.

До тех пор пока ученые не инъецировали таким мышам вирус с геном каналродопсина, это никак не сказывалось на их жизни. Кроме того (и это было очень важно для эксперимента), ученые могли временно держать этот транскрипционный фактор выключенным за счет добавления в рацион мышей специального вещества — доксициклина. Тогда даже в клетках, где содержалась вирусная конструкция, это не приводило к синтезу каналродопсинов.

Получив специальных мышей, инъецировав им в гиппокамп вирус с нужными генами и подключив животных к оптическому волокну, ученые приступили к эксперименту.

В норме мышей все время держали на доксициклине — при этом что бы они ни запоминали и чему бы ни обучались, это не приводило к синтезу светочувствительных белков. В день эксперимента доксициклин из рациона грызунов удаляли, а животных помещали в новую незнакомую клетку. В нейронах, которые отвечают за формирование памяти, начинали синтезироваться ранние белки, в том числе c-fos. Одновременно синтезировался зависимый от доксициклина транскрипционный фактор. Поскольку антибиотика в мозге уже не было, появление транскрипционного фактора приводило к синтезу светочувствительных белков в мембранах — таким образом нейроны памяти оказались помеченными.

Чтобы можно было отследить, помнят ли мыши новую клетку, ученые обращались к обычному павловскому рефлексу — давали небольшой электрический удар (когда мышь помещают в клетку, где ей когда-то пришлось испытать подобный неприятный опыт, она инстинктивно замирает).

После первой стадии эксперимента мышам начинали заново давать доксициклин, и они возвращались к обычной жизни. Затем, спустя несколько недель, грызунов с помеченными каналродопсинами нейронами вновь помещали в экспериментальные клетки.

Когда мышь сажали в ту же клетку (клетку А), где она раньше испытывала удар, она инстинктивно замирала — это, как мы говорили, хорошо известная реакция. Когда ее сажали в другую клетку (клетку B, она внешне довольно сильно отличается от A), ничего подобного не происходило. Однако когда мышей сажали в клетку В и при этом облучали мозг по оптоволокну, мышь замирала, то есть вела себя так, как будто неожиданно оказывалась в клетке A. Интересно, что с мышами, которым не прекращали давать доксициклин, ничего подобного не происходило, а это значит, что воспоминание о «неприятной» клетке активировалось именно при помощи каналродопсинов.
Впрочем, эти результаты Тонегавы были опубликованы уже довольно давно. Какое отношение они имеют к ложным воспоминаниям, ведь воспоминания мышей о клетке А были совершенно реальными?
 

Схема эксперимента с образованием ложной памяти. Вверху символически отмечены клетки, внизу — нейроны.
Изображение: Steve Ramirez et al., Science, 2013

В новом эксперименте исследователи из Массачусетского технологического института сделали еще один шаг вперед. Они решили проверить: что если связать неприятный стимул и не реальную клетку, а только воспоминание о ней?
В новом эксперименте в клетке А с мышами делали все то же самое, что и в старом, только не проводили электрический удар. Как и в прошлый раз, их нейроны оказались помечены каналродопсинами и могли активироваться в ответ на включение света. Затем мышей помещали в клетку B и начинали облучать мозг. И только после этого ученые включали электрический ток.

В одном и том же контексте метки получают одни и те же наборы нейронов: красный — белок-метка, зеленый — c-fos. Мышей метили, помещая в клетку А, а затем переносили либо обратно в клетку А (вверху), либо в клетку С (внизу).
Изображение: Steve Ramirez et al., Science, 2013

Оказалось, что воспоминания об обстановке ассоциируются с неприятными ощущениями не хуже, чем реальная обстановка: когда мышей снова переносили в клетку А (где, как мы помним, ничего плохого с ними не происходило), они замирали, как будто ожидали электрического удара. Если их помещали в третью клетку, С, которая не похожа ни на А, ни на В, ничего подобного не происходило. Интересно, что даже тогда, когда их помещали в клетку В, где на самом деле имел место электрический удар, они реагировали довольно слабо. Это говорит о том, что воспоминания о клетках А и В мешали друг другу.

Считать ли такое необычное поведение мышей ложной памятью? С формальной точки зрения она ей, безусловно, является, так как мыши помнят как опасную другую клетку. Авторы в данном случае ни на йоту не преувеличивают свои достижения. Но все же и удар, и клетка имели место в реальности. Если же кто-то думал, что под ложной памятью подразумевалось что-то вроде того, о чем идет речь в фильме «Вспомнить все», то ему придется подождать еще.
Александр Ершов


http://lenta.ru/articles/2013/08/03/pseudomem/